好消息一：

C12-200有效遞送siRNA^[1]，通過組合篩選，可實現低劑量，高效率的基因沉默效果。

好消息二：

AVT的C12-200已上線，歡迎詢價采購。

在發現和開發能夠引導小干擾RNA(SiRNA)通過許多屏障保護目標細胞內部的載體方面，人們做出了巨大的努力。雖然研究已經顯示基因沉默在體內的潛力，但要發揮RNA干擾療法的zui廣泛潛力，必須提高給藥效果。通過組合，合成和篩選不同類別的材料，已經確定了一種能使siRNA引導的小鼠肝臟基因沉默的配方，其劑量低于0.01毫克/千克。這種制劑在一次注射后還能同時抑制五個肝基因的表達。這種制劑的潛力在非人類靈長類動物中得到進一步驗證，在這種情況下，在低至0.03mg/kg的劑量下，觀察到臨床相關基因轉胸腺肽的高度敲除水平。據文章所示，這種制劑有助于基因沉默，其劑量比任何先前描述的siRNA肝傳遞系統所要求的低一個數量級。

Lipidoid-siRNA制備

Lipidoid-siRNA制劑的體內篩選是由類脂，膽固醇，和PEG脂質組成。在100、20和100 mg/mL的無水乙醇中分別溶解得到了類脂、膽固醇和DMG-mPEG 2000的原液。各組分按照比例組合，質量比為52：20：28。在200 mM的醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)中加入有機相，攪拌形成空脂質體。在50 mm的醋酸鈉溶液中加入10 mg/mL的siRNA，以總脂質：siRNA為10：1的比例，將siRNA加入空脂質體中，在37?℃下孵育30 min。然后用3,500 MWCO的透析盒(皮爾斯)對PBS進行透析75 min。在緩沖液交換后，每種制劑的樣品被用于粒子的表征。采用改良的RiboGreen法(Invitrogen)定量siRNA的包封率，用動態光散射法測量平均粒徑。

用Jeffs等人提出的方法制備了C12-200-siRNA。用90%乙醇(摩爾比50：10：38.5：1.5)對C12-200、DSPC、膽固醇和mPEG 2000-DMG進行增溶。siRNA在10 mm檸檬酸鹽溶液中溶解（pH3.0，緩沖液濃度為0.4mg/mL）。用裝有雙相泵頭的蠕動泵，在等效體積流量下，混合在“T"結中，對乙醇脂質溶液和siRNA水溶液進行了泵提。脂質與siRNA的結合比例為7：1(wt:wt)。用PBS(155 mm NaCl，3mm Na2HPO4，1mm KH2PO4，pH7.5)對自發形成的C12-200-siRNA進行透析，去除乙醇和交換緩沖液。

組合設計

圖1：通過組合，設計了陽離子脂質化合物庫。

基于脂質的載體介導的siRNA體外釋放。

以熒光素酶表達的Hela衍生細胞株為研究對象，以高通量的方式篩選脂質類材料。對這些細胞進行基因修飾，穩定表達酶。在本實驗中，以質量比2.5：1，5：1，10：1和15：1的脂質：siRNA進行絡合，并與細胞在生長培養基中孵育。熒光素酶的表達在不發生腎素還原的情況下被認為是siRNA介導的沉默，而renilla的表達被作為脂質相關毒性的內部對照。細胞毒性試驗也沒有任何不良反應的證據。在這個篩選中，發現了許多有助于熒光素酶沉默的化合物，其中三個化合物的沉默率超過90%。為了便于展示，只顯示了5：1的質量比的數據。有趣的是，從這些結果中出現了許多結構-活動關系。就尾部長度而言，在15種性能好的結構中，有7種結構的尾長為14碳。此外，尾巴長度小于12-碳的化合物也不會引起大于30%的沉默。在頭部基團設計中，amine 113存在于前兩種化合物和前15種化合物中的三種。雖然在C14尾和amine 113上的趨同是明顯的，但并不是所有含有這些結構的化合物都表現出沉默活性。例如，在體外，C8-113和C14-116都不能促進基因沉默，這表明通過優化胺基和尾長的組合來提高傳遞效率是必要的。

圖2：脂質體庫的體外篩選

在表達熒光素酶的Hela細胞中，對脂質體進行篩選。（A）將抗熒光素酶的siRNA與可電離陽離子脂質復合，與培養基中的細胞共同孵育。（B）小劑量siRNA沉默熒光素酶。

圖3：在小鼠體內沉默FVII因子。

圖4：通過檢測FVII蛋白水平，觀察C12-200介導的基因沉默在體內持續時間超過40天。

圖5：五個位于肝臟的基因靶點。

據我們所知，這是關于siRNA介導的五個肝臟靶點在體內同時沉默的最早報道?？紤]到C12-200介導的遞送的效力，我們假設更多的基因可以同時被合并的siRNA產物沉默。從治療的角度來看，這可以實現更復雜的治療方法，其中多個靶點的沉默可以獲得增強的治療效果。例如，這種策略可能特別適用于治療病毒感染，如丙型肝炎病毒（HCV），在這種病毒感染中，快速進化的病毒基因組已被證明對單一序列的siRNA難以實現。事實上，這一想法以前已經在體外證明，利用核糖核酸內切酶制備的siRNA和編碼針對HCV基因組多個區域的短發夾RNA的逆轉錄病毒載體進行遞送。這種多靶點治療方法還可以采用不同的策略來治療多因素疾病，如代謝綜合征、癌癥或感染性疾病

圖6:C12-200-siRNA顆粒通過大細胞吞噬引起細胞攝取

（A） 用C12-200配制的熒光標記的siRNA與HeLa細胞在各種內吞途徑的標記標記物存在下孵育。含有siRNA的顆粒與標記的葡聚糖共定位，葡聚糖是一種已知通過大細胞吞噬作用進入細胞的液相標記物（白色箭頭）。（B） 肌動蛋白纖維的熒光標記揭示了在HeLa細胞暴露于C12-200-siRNA顆粒的15分鐘內，膜褶皺（白色箭頭）和肌動蛋白重排，這是大胞飲攝取的標志性指標。（C，D）細胞先前暴露于EIPA和Cytochalasin D，分別是大胞飲和肌動蛋白聚合的抑制劑，以劑量依賴性的方式減少C12-200-siRNA顆粒的攝取。（s.d.，n=3，***P<0.005；**P<0.01；*P<0.05

圖7:C12-200對非人類靈長類動物的治療效果。

食蟹猴（每組n=3）通過頭靜脈接受PBS或0.03、0.1或0.3 mg/kg在C12-200中配制的siTTR，作為15分鐘的靜脈輸注（5 mL/kg）。在給藥后48小時從動物身上采集肝活檢。在肝臟樣品中測定TTR mRNA水平相對于GAPDH mRNA水平。數據點代表組平均值±s.d

本研究最終認為：開發安全有效的siRNA遞送載體是基于RNAi的治療方法持續進步的重要組成部分。隨著C12-200等高效材料的鑒定，可以實現更寬的治療指數、持久的基因沉默和多靶點治療疾病的方法。

Reference：

[1]. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing